服务|概述
如何启动服务
有兴趣的人可以联系副核心主任，讨论初步的方法，打算创建一个小鼠模型。使用鼠标核心服务在BCH生成鼠标模型的主要要求是PI必须具有所需模型的经过批准的IACUC和IBC协议。批准后，小鼠核心将与PI或实验室成员协调提交申请表格，并在安排实验前提供所需的试剂。
需求
- 为所需的小鼠模型批准IACUC和IBC协议。
- 提交由PI和指定实验室成员签署的服务电子申请表。
- 在安排实验前，小鼠核心将与PI或实验室成员协调收集所需的试剂。
- 用于偿还所请求服务费用的基金编号或采购订单编号。
你有问题吗?电邮至transgenicmouse@childrens.harvard.edu而且Mantu.Bhaumik@childrens.harvard.edu
基因编辑服务
使用CRISPR/Cas9试剂编辑小鼠基因组。用户可选择设计指导RNA、供体模板或使用商业服务。我们强烈推荐使用合成的引导RNA, PAGE纯化的单链寡核苷酸供体/s和Cas9蛋白。此外，如果双链供体结构被用作供体模板，那么DNA必须按照下面所述进行纯化。由于gRNA的切割效率不同，通常建议每个靶点有2-3个gRNA在活的有机体内．
显微镜下注射服务
原核的注入
- 将CRISPR/Cas9试剂注入受精卵产生方正菌
- 单基因或多基因敲除
- loxp或frt使用单链寡核苷酸供体(ssODN)的floxed等位基因
- 利用ssODN引入特定的点突变
- 使用ds-Donor结构的报告小鼠
- 使用ds-Donor结构的基因靶向创始人
- 记者敲入ROSA26位点
- 转基因DNA构建受精卵原核(B6, F1, FVB或突变株)
- 转基因BAC DNA构建于受精卵原核中
囊胚注射
- 基因靶向ES细胞导入宿主囊胚产生嵌合小鼠
- 将野生型或报告型胚胎干细胞引入突变囊胚以产生嵌合小鼠
- 从KOMP/EUCOMM/IMMRC导入ES细胞株
- 小鼠诱导多能干细胞(iPSC)引入囊胚
基因靶向小鼠胚胎干细胞服务
基因靶向载体DNA由PI构建并提供到核心，通过电穿孔引入mES细胞，然后进行药物选择。存活的单株被采摘并在96个井中生长。复制板一半冷冻，另一半用于基因分型，以识别正确的同源重组事件。确认后，扩增阳性克隆制备冷冻株，对正常染色体数进行核型分析。经验证后，建议将2-3个独立克隆注射到囊胚中产生嵌合小鼠。P21断奶后嵌合体转移到PI。
我们还在mES细胞系中提供CRISPR/Cas9介导的基因靶向。
嵌合小鼠:我们已经证明了通过胚泡注射从不同小鼠品系生成嵌合小鼠的经验。我们提供C57Bl/6作为标准胚泡供体菌株，但是，我们提供使用Albino/B6的胚泡注射，需要额外收费。进口mES细胞必须检测为阴性支原体sp。
服务的事实
- 利用来自C57Bl/6 (JM8.A3.N1)、F1 (v6.5)或129Sv (J1)菌株的mES细胞，通过同源重组(HR)进行基因靶向。用户可以选择96孔格式的克隆数量和屏幕菌落来成功重组事件。
- 基因打靶在体外使用CRISPR/Cas9试剂也提供了微注射到受精胚胎的替代方案。
- 扩增同源重组鉴定阳性ES克隆
- ES细胞核型
转基因老鼠服务
用户设计和创建转基因DNA结构，通过原核微注射产生创始人小鼠。我们建议使用Qiagen endotoxin free max - prep或任何等效试剂盒来制备质粒DNA或使用核心提供的质粒DNA制备服务。转基因结构物通过限制性内切酶从质粒骨架中释放出来，转基因DNA在核心部位用琼脂糖凝胶纯化，以确保质量可控的试剂成功生成创始人小鼠。
我们将在0.5天对受精卵进行原核微量注射post-coitum用纯化的转基因DNA或CRISPR/Cas9试剂，将微注射胚胎移植到受体寄养雌性。大约3周后，幼崽出生，并在P7或P8进行尾部活检以进行基因分型。基因分型结果必须在P21断奶前提供。经ARCH或接收机构批准后，已确定的创始人转移给调查员。
我们的目标是提供至少两个创始人/转基因结构或CRISPR项目。如果两个创始人不能通过两次微注射实现，那么我们将进行额外的会议，收取额外的费用。低温贮藏
冷冻保存，体外受精和再胎服务
胚胎/精子/细胞系储存服务表格[下载PDF]
胚胎冷冻保存服务表格[下载PDF]
精子冷冻保存服务表格[下载PDF]
再报关服务表格[下载PDF]
小鼠品系通过在高安全性无菌吸管中冷冻胚胎或精子进行低温保存，并在液氮下储存在IMV Cryo-Bio存储系统中。
请注意，冷冻保存服务只适用于ARCH设施内的老鼠窝。
胚胎冷冻保存:研究人员提供6-10个经生育能力测试的杂合或纯合雄性，用于与野生型卵子供体雌性交配以收获胚胎。如果来自同一品系的雌性供体用于交配，那么研究人员负责提供3-4周龄的雌性供体。在收获所需数量的胚胎并冷冻后——通过解冻胚胎并重新植入养母来评估恢复情况，允许怀孕足月并通过活产确认。
在高安全性无菌吸管中提供了三种8细胞期胚胎冷冻保存方案。每根吸管包含20-30个胚胎，储存在IMV冷冻生物系统高脚杯中。
1) 100-150个胚胎-快速和经济的选择存档菌株(Cryo-1)
2) 150-300个胚胎-一个品系长期储存，偶尔恢复(Cryo-2)
3) 300-450个胚胎-一个品系的大量胚胎库，用于存储，如果预期定期恢复或未来分布(Cryo-3)。
精子冷冻保存:也提供存档鼠标品系。然而，由于男性冷冻/解冻精子的高变异性，无法保证恢复。我们需要三名经过生育能力测试的男性，用于收集精子，并如前所述储存在高度安全的无菌吸管中。通常5-8根吸管/男性冷冻。恢复是通过使用野生型卵子供体女性进行体外受精，并将受精胚胎移植到养母体内，然后活产来测试的。
ES细胞衍生:我们提供从转基因，基因靶向或任何其他小鼠模型衍生的ES细胞系。PI提供雄性和雌性来获取囊胚并建立胚胎干细胞系。细胞系的总数取决于从特定菌株中获得的囊胚的质量和数量。
服务的事实
- 8细胞期的胚胎在液氮下冷冻储存
- 精子冷冻保存通过收集2-3个生育能力测试男性的精子和在液氮下储存的冷冻精子来进行
- 活幼崽恢复在体外使用冷冻解冻的精子进行受精
- 对年龄/性别/基因型匹配的队列使用新鲜精子进行体外受精
- 通过胚胎移植或体外受精重新衍生进口小鼠品系
配套服务
- 用于微注射或基因靶向的转基因DNA构建纯化、质、量分析
- 从96孔至10厘米板的ES克隆中提取DNA
- 鼠尾DNA提取
- 用丝裂霉素c处理小鼠原代胚胎成纤维细胞的mES喂养层
- 小鼠胚胎在E7.5- E18.5收获
- 从突变小鼠株中建立mES细胞系
- 进口精子或胚胎液氮储罐储存。
定价
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